发布日期：2025-01-22 14:54    点击次数：193

作者：李自慧，孙琦，杜博平，贾红彦，董静，吕翎娜，朱传智，邢爱英，杨新婷，魏荣荣，陈效友，张宗德，潘丽萍第一作者及单位：李自慧，首都医科大学附属北京胸科医院，北京市结核病胸部肿瘤研究所，耐药结核病研究北京市重点实验室通信作者及单位：潘丽萍，张宗德，首都医科大学附属北京胸科医院，北京市结核病胸部肿瘤研究所，耐药结核病研究北京市重点实验室Use of Pleural Fluid Digital PCR Analysis to Improve the Diagnosis of Pleural TuberculosisZihui Li, Qi Sun, Boping Du, Hongyan Jia, Jing Dong, Lingna Lyu, Chuanzhi Zhu, Aiying Xing, Xinting Yang, Rongrong Wei, Xiaoyou Chen, Zongde Zhang, Liping PanMicrobiology Spectrum, 2022 Oct 20：e0163222.doi: 10.1128/spectrum.01632-22. PMID: 36264250研究背景结核病是严重威胁人类健康的传染病。2020年，全球估计有987万例新发结核病患者，约有151万例因此而死亡。结核性胸膜炎是一种常见的结核病类型，可引起胸膜增厚、结核性脓胸、乳糜胸和气胸等并发症，从而导致肺功能损害、慢性胸痛或呼吸困难，给患者带来极大危害。快速诊断和及时治疗可降低严重并发症的发生风险。然而，结核性胸膜炎的诊断具有一定的挑战性。由于胸腔积液中结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）含量一般很少，病原学检测阳性率通常较低，例如，胸腔积液涂片染色镜检的敏感度通常<10%，分枝杆菌培养的敏感度通常<30%，GeneXpert MTB/RIF（Xpert）和Xpert Ultra的检测敏感度也分别介于21.4%～22.7%和37.5%～48.2%，而免疫学方法和生化参数诊断结核性胸膜炎的准确度也较差。因此，迫切需要新的方法来改善结核性胸膜炎的诊断水平。数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction，dPCR）是一种绝对定量微量核酸的有效方法。相比实时定量PCR，dPCR具有准确度高、重复性好、对抑制剂耐受性高、定量不需要标准曲线等优点。故本研究旨在评估胸腔积液dPCR检测对结核性胸膜炎的诊断性能。研究方法1. 研究对象。连续性纳入于首都医科大学附属北京胸科医院就诊的年龄≥16岁的胸腔积液患者。所有纳入患者均进行一些检测以帮助明确诊断，具体为：MRI、CT、超声检查；与结核病相关的胸腔积液检测（包括涂片抗酸染色镜检、分枝杆菌培养、Xpert和MTB抗体检测）和血液检测[包括IFN-γ释放试验（IGRA）和MTB抗体检测]；胸腔积液生化、病理或胸膜病理学检测等。本研究通过首都医科大学附属北京胸科医院医学伦理委员会批准。2. 病例分组。（1）确诊结核性胸膜炎组：影像学符合结核性胸膜炎且胸腔积液病原学检测结果为阳性（MTB涂片镜检、培养或核酸检测），或影像学符合结核性胸膜炎且胸腔积液或胸膜病理学检查阳性。（2）临床诊断结核性胸膜炎组：胸腔积液病原学检测结果阴性，但影像学符合结核性胸膜炎；胸腔积液为渗出性，其腺苷脱氨酶（ADA）升高，同时免疫学检测阳性[结核菌素皮肤试验（TST）、IGRA或MTB抗体]。（3）非结核性胸腔积液组：明确诊断为其他疾病。所有检查均未提示合并结核病。3. 胸腔积液收集和DNA提取。收集每例患者30～50 ml 胸腔积液进行常规临床检测，剩余胸腔积液室温下2000×g 离心10 min，上清液分装冻存于－80 ℃。使用DNeasy Blood and Tissue Kits（69506, Qiagen, Hilden, Germany）试剂盒批量提取700 µl 胸腔积液DNA，洗脱体积为50 µl。DNA样品冻存于－80 °C，直至行dPCR检测。4. dPCR检测。本研究检测靶标为MTB特异性插入序列IS6110和IS1081。20 µl反应体系包含10 µl ddPCRTM supermix for probes，0.9 µM每条引物，0.2 µM每条探针，0.3 U尿嘧啶-N-糖基化酶和5.3 µl DNA模板。将反应体系和70 μl微滴生成油添加到卡槽中，盖上胶垫，置于微滴生成仪生成微滴。将全部微滴转移至96孔板后，180 °C 10 s热封。PCR反应条件：37 °C 10 min，95 °C 10 min；94 °C 30 s，54 °C 40 s ，循环40次；98 °C 10 min，温度升降速率为2.0 °C/s。扩增完成后，将平板加载到微滴读取仪，获取每个微滴的荧光信号。使用QuantaSoft Version 1.7.4.0917软件进行数据分析。每次实验均采用无模板阴性对照和MTB基因组阳性对照。每份样品分别进行两次独立检测，每次均设复孔，最后结果取平均值。5. 统计学处理。使用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计数资料采用卡方检验或McNemar检验，连续性计量资料采用Student’s t检验、Mann-Whitney U检验或Wilcoxon检验。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）进行诊断价值分析。采用多元logistic回归模型进行风险因素分析。采用Spearman相关性检验分析方法的一致性。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果1. 病例纳入。共纳入310例胸腔积液患者，其中，男性215例（69.4%），年龄范围为16～93岁，中位数年龄为55岁；结核性胸膜炎患者183例（包括确诊92例和临床诊断91例），其中，88%（161/183）的结核性胸膜炎患者伴有肺部或其他器官结核病灶；非结核性胸腔积液患者127例，包括：恶性胸膜间皮瘤12例、肺癌合并胸膜转移92例（鳞癌4例，腺癌77例，小细胞癌11例）、其他癌症合并胸膜转移23例（乳腺癌5例，卵巢癌1例，胸腺瘤1例，食管癌1例，尤文氏肉瘤1例，非霍奇金淋巴瘤1例，原发部位不明的恶性胸膜积液13例）。所有患者中，结核性胸膜炎组患者年龄低于非结核性胸腔积液组，男性比例也偏高。2. 胸腔积液dPCR检测范围和可重复性。IS6110-dPCR在 2.3~82067 拷贝/20 μl反应体系、IS1081-dPCR在 3.0~27520 拷贝/20 μl反应体系的动态范围内，实际检测到的靶标数量与预期靶标数量之间具有很好的相关性（R2均为0.99）。不同浓度的模板分别进行两次dPCR检测结果的变异系数分析表明，IS6110和IS1081两个靶标的dPCR检测具有较好的可重复性。3. 胸腔积液dPCR检测结果。IS6110和IS1081的dPCR检测结果高度相关（r=0.838，P<0.0001），同一份结核性胸膜炎样本中检测到的IS6110拷贝数通常多于IS1081（P<0.0001）。结核性胸膜炎组检测到的靶标拷贝数[中位数（最小值，最大值）]明显高于非结核性胸腔积液组：IS6110，4.3（0.0，9990.0）和0.0（0.0，2.6）拷贝/20 μl反应体系，P<0.0001；IS1081，1.5（0.0，2020.0）和0.0（0.0，2.1）拷贝/20 µl反应体系，P<0.0001。确诊结核性胸膜炎组检测到的靶标拷贝数[中位数（最小值，最大值）]明显高于临床诊断组：IS6110，9.9（0.0，9990.0）和1.1（0.0，641.0）拷贝/20 μl反应体系，P<0.0001；IS1081，3.5（0.0，2020.0）和0.9（0.0，191.0）拷贝/20 µl反应体系，P<0.0001。4. 胸腔积液dPCR检测对结核性胸膜炎的诊断性能。IS6110-dPCR的ROC曲线下面积大于IS1081-dPCR[0.85（95% CI：0.80～0.89）和0.79（95% CI：0.75～0.84），P=0.002]。确诊结核性胸膜炎组ROC曲线下面积大于临床诊断组。以每20 μl反应体系中 2.6（IS6110）和 2.1（IS1081）拷贝为界值，IS6110-dPCR诊断结核性胸膜炎的总敏感度高于IS1081-dPCR（57.4% 和 40.4%，P<0.001），特异度均为100%。dPCR诊断确诊结核性胸膜炎组的敏感度高于临床诊断组（IS6110，71.7%和42.9%；IS1081，56.5%和 24.2%）。IS6110 或 IS1081-dPCR（其中一个靶标阳性定义为阳性，两个靶标均为阴性定义为阴性）诊断结核性胸膜炎、确诊结核性胸膜炎和临床诊断结核性胸膜炎的总的敏感度分别为59.0%、72.8%和45.1%，特异度均为100%。5. 胸腔积液IS6110或IS1081-dPCR与其他方法的敏感性比较。胸腔积液的IS6110或IS1081-dPCR诊断结核性胸膜炎的敏感度明显高于胸腔积液涂片镜检（57.4%和7.1%）、分枝杆菌培养（55.3%和31.8%）和Xpert（57.6% 和23.0%）三种病原学检测方法（P值均<0.001）。与免疫学方法相比，胸腔积液的IS6110或IS1081-dPCR检测敏感度低于外周血T-SPOT.TB检测（58.8% 和91.9%，P< 0.001），但高于外周血和胸腔积液MTB抗体检测（60.7%和 42.9%，P=0.002；71.5%和40.4%，P=0.002）。其与胸膜活检联合抗酸杆菌检测或胸腔积液ADA测定（界值为40 U/L）诊断结核性胸膜炎的敏感度差异均无统计学意义（58.8%和47.1%，P=0.727；64.2%和70.1%，P=0.358）。6. 结核性胸膜炎dPCR检测阴性结果的风险因素分析。多元logistic回归模型分析显示，长抗结核治疗时间（>1个月）是结核性胸膜炎dPCR检测阴性结果的独立风险因素（OR=3.541，P=0.025）。抗结核治疗≤1个月样本组中dPCR检测到的靶标数量和阳性率均高于抗结核治疗>1个月样本组。研究结论胸腔积液IS6110 或IS1081-dPCR检测是一种准确的、可提供MTB病原学证据的分子生物学检测方法，其敏感度高于临床上常用的病原学诊断方法，有改善结核性胸膜炎诊断的潜力。注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。供稿：李自慧编辑：孟    莉审校：范永德发布日期：2022-11-08